Забор, хранение и транспортировка материала

В табл. 9 суммированы данные о заборе, хранении и транспортировке крови для определения вирусологических и иммунологических показателей при ВИЧ-инфекции.

 

Таблица 9 – Данные о заборе, хранении и транспортировке крови для исследований

исследование	объем крови	анти-коагулянт	подготовка пробы	хранение и транспортировка
Количество CD4 лимфоцитов	3-5 мл	ЭДТА	перемешать** и закрыть	до 4 часов при комнатной tо (не в холодильнике!)
Качественное определение ВИЧ	1-2 мл	ЭДТА *	перемешать** и закрыть	до 4 суток при +2+8оС (не замораживать!)
Вирусная нагрузка или определение лекарственной резистентности	2-3 мл	ЭДТА *	перемешать и закрыть	до 6 ч при +2+8оС
выделить плазму – центрифугирование со скоростью 80-100 оборотов/мин в течение 20 мин	до 1 суток при +2+8оС, при заморозке: -20оС – 1 месяц -80оС – 6 месяцев

* нельзя добавлять такие антикоагулянты как гепарин и цитрат натрия, так как они ингибируют ПЦР

** перемешивание необходимо для недопущения образования сгустка, но оно должно быть аккуратным, чтобы не привести к разрушению клеток крови

 

Оптимально, когда забор крови происходит непосредственно рядом с лабораторией, которая будет выполнять исследования, поскольку длительность и условия хранения и транспортировки материала могут повлиять на результат. Длительность и условия хранения наиболее лимитированы при исследовании образцов крови на количество CD4 лимфоцитов и вирусную нагрузку.

Хранить кровь для определения количества CD4 лимфоцитов допустимо до 4 часов при комнатной температуре, поскольку при более длительном хранении или при хранении при более низкой температуре происходит разрушение клеток крови, и результат теста будет искусственно занижен. Имеется методика пересчета результатов теста с использованием поправочных коэффициентов на «старение крови» при ее хранении, но все же более достоверный результат будет получен при постановке теста в те сроки от забора крови, которые оговорены инструкцией. Клетки крови могут быть также разрушены при неаккуратном перемешивании и небрежной транспортировке.

Хранить цельную кровь для определения вирусной нагрузки можно также недолго – до 6 часов при температуре холодильника, поскольку содержащиеся в плазме человека РНК-азы будут постепенно разрушать РНК ВИЧ, и вирусная нагрузка при длительном хранении крови будет снижаться. При необходимости более длительного хранения следует отцентрифугировать кровь, отделить плазму и заморозить ее.

Кровь, забранную для качественного определения ВИЧ (в ДНК ПЦР), не следует замораживать, поскольку будут разрушены лимфоциты, в которых и находится интегрированная ДНК ВИЧ. При необходимости длительного хранения крови следует отцентрифугировать ее, отделить монослой лимфоцитов и заморозить.

Клиническое использование результатов тестов

 

Определение ВИЧ-статуса

В настоящее время в Беларуси обеспечена широкая доступность тестирования на ВИЧ. В приложении №4 к приказу МЗ РБ от 16.12.1998 г. № 351 определено, что «Право на анонимное и добровольное обследование на наличие антител к вирусу иммунодефицита человека предоставлено любому гражданину, независимо от места жительства, в любом лечебно-профилактическом учреждении, имеющем процедурный кабинет».

Добровольность тестирования на ВИЧ подразумевает либо добровольное включение в тестирование (при наличии желания/ запроса самого пациента), либо добровольное исключение (предложение о тестировании исходит от врача, а пациент имеет возможность согласиться или отказаться).

Кроме того, в приложении 8 к приказу МЗ РБ от 16.12.1998 г. № 351 определен «Перечень контингентов, подлежащих обследованию на наличие антител к вирусу иммунодефицита человека», то есть подлежащих обязательному тестированию на ВИЧ. В кратком изложении данный перечень может быть представлен следующим образом:

§ доноры;

§ иностранные граждане;

§ лица из очагов: бывшие в половом контакте с ВИЧ-позитивным или в сходных условиях по риску заражения ВИЧ;

§ по клиническим показаниям (при наличии проявлений некоторых оппортунистических инфекций или ряда возможных признаков иммунодефицита) – обследуются как пациенты, так и аутопсийный материал;

§ получающие частые гемотрансфузии;

§ плацентарная кровь, поступающая на переработку;

§ дети ВИЧ-позитивных матерей или оформляющиеся в госучреждения;

§ пациенты с инфекциями, передающимися половым путем;

§ потребители инъекционных наркотиков, мужчины имеющие секс с мужчинами, женщины секс бизнеса;

§ поступившие в следственный изолятор или приемник-распределитель;

§ медработники в случае профессионального контакта;

§ а также все изъявившие пройти обследование, в том числе анонимно.

Руководство IDSA по оказанию первичной медицинской помощи приводит следующие показания к тестированию на ВИЧ:

§ взрослые из групп риска, частота выявления ВИЧ-инфицированных в которых составляет >1%;

§ беременные;

§ жертвы сексуального насилия;

§ контакт с ВИЧ на рабочем месте;

§ личное желание пройти тестирование на ВИЧ.

При постановке теста на ВИЧ проводится до- и послетестовое консультирование пациентов, согласно приказу МЗ РБ от 13.12.2001 №712-А «О проведении консультирования по вопросам ВИЧ-инфекции пациентов лечебно-профилактических учреждений».

Рекомендуемая частота обследования на ВИЧ-инфекцию зависит от конкретной ситуации. Так, пациентам из групп высокого риска обычно рекомендуют обследоваться ежегодно, поскольку они имеют высокие показатели частоты ежегодной сероконверсии (если для населения в целом этот показатель составляет 0,001%, для военнослужащих срочной службы – 0,04%, то для мужчин имеющих секс с мужчинами – 0,5–2% с более высоким риском у молодых, а для потребителей инъекционных наркотиков в регионах с высокой распространенностью ВИЧ-инфекции – 0,7–6%).

Рутинно используемый диагностический алгоритм обследования на ВИЧ-инфекцию включает определение антител в ИФА, выполненном двукратно, с последующим подтверждением в ИБ.

Обобщенная диагностическая схема представлена на рис. 9, детали наблюдения при различных результатах первичного тестирования в ИФА и ИБ описаны в приложении 12 к приказу МЗ РБ от 16.12.1998 г. № 351 «Организация диспансерного наблюдения за ВИЧ-инфицированными и подозрительными на заражение ВИЧ лицами».

 

 

Рис. 9. Диагностический алгоритм обследования на ВИЧ-инфекцию

 

Диагноз ВИЧ-инфекции подтверждается при получении положительных результатов двух ИФА и одного ИБ. Если получены отрицательные результаты ИФА или ИБ, но при консультировании установлено, что пациент имел риск заражения ВИЧ в недавнем прошлом (в последние 6 месяцев), то через некоторое время (обычно через 1-3-6 месяцев) проводится повторное обследование в ИФА/ ИБ или проводится качественная ПЦР. Если получены отрицательные результаты ИФА или ИБ, и при консультировании установлено, что пациент не имел риска заражения ВИЧ в недавнем прошлом, диагноз ВИЧ-инфекции исключается.

Диагностический алгоритм обследования на ВИЧ-инфекцию детей, рожденных ВИЧ-позитивными матерями, включает определение ДНК ВИЧ (качественная ПЦР) и антител к ВИЧ (ИФА и ИБ).

«Инструкция по медицинскому наблюдению за ВИЧ-экспонированными/ инфицированными детьми», утвержденная приказом МЗ РБ от 05.09.2003 г. № 147, регламентирует проведение качественной ПЦР в 2 и 4 месячном возрасте и определение антител к ВИЧ в ИФА/ ИБ в возрасте 6, 12 и 18 месяцев. Получение двух отрицательных результатов качественной ПЦР позволяет исключить диагноз ВИЧ-инфекции, но снятие ребенка с диспансерного учета по ВИЧ-экспоненции происходит после получения двух отрицательных результатов определения антител в ИФА/ ИБ (обычно в 18-месячном возрасте).

Рекомендации ВОЗ 2006 г. определяют проведение качественной ПЦР детям в возрасте 48 часов после рождения, затем в 1,5 и 3 месяца. Причем отрицательный результат первого ПЦР-теста, выполненного в возрасте 48 часов после рождения, клинически не трактуется, поскольку при интранатальном заражении вирус появляется в крови позже.