Кормораздатчик мобильный электрифицированный: схема и процесс работы устройства...
Археология об основании Рима: Новые раскопки проясняют и такой острый дискуссионный вопрос, как дата самого возникновения Рима...
Топ:
Особенности труда и отдыха в условиях низких температур: К работам при низких температурах на открытом воздухе и в не отапливаемых помещениях допускаются лица не моложе 18 лет, прошедшие...
Марксистская теория происхождения государства: По мнению Маркса и Энгельса, в основе развития общества, происходящих в нем изменений лежит...
Комплексной системы оценки состояния охраны труда на производственном объекте (КСОТ-П): Цели и задачи Комплексной системы оценки состояния охраны труда и определению факторов рисков по охране труда...
Интересное:
Распространение рака на другие отдаленные от желудка органы: Характерных симптомов рака желудка не существует. Выраженные симптомы появляются, когда опухоль...
Подходы к решению темы фильма: Существует три основных типа исторического фильма, имеющих между собой много общего...
Финансовый рынок и его значение в управлении денежными потоками на современном этапе: любому предприятию для расширения производства и увеличения прибыли нужны...
Дисциплины:
2024-02-15 | 24 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Наступний після створення бібліотеки етап - це розшук клону (клонів), які містять необхідну послідовність ДНК. Для цього використовують три методи: гібридизацію з міченим ДНК-зондом з наступним радіоавтографічним аналізом; імунологічний скринінг (ідентифікація одиничного об’єкту шляхом перевірки чисельних об’єктів); скринінг за активністю білку, який кодується геном – мішенню.
Скринінг за допомогою гібридизації. Необхідну нуклеотидну послідовність у зразку ДНК можна виявити за допомогою ДНК-зонду, який з’єднується лише з послідовністю, що розшукується.
ДНК-гібридізація полягає в тому, що ДНК-мішень піддають денатурації (роз’єднанню ланцюгів ДНК під дією теплової обробки або впливу лугів) і одноланцюгові молекули міцно приєднують до твердої підложки (нітроцелюлозного або нейлонового фільтру). Потім фільтр інкубують з одноланцюговим ДНК-зондом, який помічений радіоізотопами або іншими мітками. Якщо нуклеотидні послідовності зонду і ДНК-мішені комплементарні, то відбувається їх спарування (тобто гібридизація). Гібридні молекули можна виявити радіографічним або іншими методами. Для гібридизації необхідно, щоб на ділянці довжиною 50 нуклеотидів співпадало більш 80% з них.
Мічені ДНК-зонди для скринінгу бібліотеки можна отримати як найменш двома способами. По-перш, можна використовувати клоновану ДНК близькоспорідненого організму (гетеролітичний зонд). По друге, зонд можна отримати методом хімічного синтезу, заснованого на відомій амінокислотній послідовності білкового продукту гену, який розшукується.
Імунологічний скринінг. При відсутності ДНК-зонду можна використовувати інші методи, наприклад, якщо клонований ген здатний до експресії (реалізації генетичної інформації), то його продукт – весь білок, або його частину – можна виявити імунологічними методами. Всі клітинні лінії (клони) бібліотеці висівають на чашки з поживним середовищем. Колонії, що виросли, переносять на фільтр, клітини лізірують (руйнують), а білки, що звільнилися, фіксують на фільтрі. Після цього на фільтр наносять перші антитіла, які специфічно зв’язуються з певним білком (антигеном); усі антитіла, що не зв’язалися віддаляють, а фільтр поміщають у розчин других антитіл, специфічних до перших антитіл. Часто використовують кон’югати других антитіл з ферментом, під впливом якого відбувається гідроліз субстрату з утворенням забарвленої речовини в тому місті, де здійснюється реакція.
|
Скринінг за активністю білку. В тому випадку, коли ген, що розшукується, кодує фермент, який не синтезується клітиної-господарем, використовують метод ідентифікації на чашках. Для виявлення клонів, які містять цей ген, клони Е.соІі, що складають геномну бібліотеку даного організму (клітини-господарі), висівають на середовищі із специфічним субстратом. Клітини, які здатні утилізувати цей субстрат, після фарбування набувають певного забарвлення.
Якщо ген, що розшукується, кодує продукт, без якого клітина-господар не здатна рости на мінімальному середовищі, то бібліотеку можна створювати методом трансформації мутантних клітин. Клони, що не містять цього гену будуть гинути, а на мінімальному поживному середовищі залишаться лише клітини, до складу яких увійшов необхідний ген.
|
|
Наброски и зарисовки растений, плодов, цветов: Освоить конструктивное построение структуры дерева через зарисовки отдельных деревьев, группы деревьев...
История создания датчика движения: Первый прибор для обнаружения движения был изобретен немецким физиком Генрихом Герцем...
Поперечные профили набережных и береговой полосы: На городских территориях берегоукрепление проектируют с учетом технических и экономических требований, но особое значение придают эстетическим...
Общие условия выбора системы дренажа: Система дренажа выбирается в зависимости от характера защищаемого...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!