D ) Просмотр препарата с использованием иммерсионного объектива.

Поместить каплю вазелинового масла на мазок. Опустить объектив микроскопа до соприкосновения с каплей. Навести резкость, используя сначала макровинт, а затем - микровинт. Необходимо использовать специализированный объектив 90^x для иммерсионной микроскопии (обычно маркирован сбоку черной полосой). Принцип иммерсионной техники представлен на рис. 4.

Для просмотра препарата с помощью светового микроскопа, используют искусственный источник освещения, помещенный снизу от объекта. При этом, лучи света отклоняются каждый раз, проходя через границу сред с различным показателем преломления: предметное стекло - воздух, воздух - стеклянная линза (левая сторона рисунка). Это приводит к уменьшению четкости изображения. Для того чтобы избежать этой проблемы, между предметным стеклом и линзой помещают иммерсионную среду (например, вазелиновое масло), близкую по показателю преломления к стеклу. Такая иммерсионная среда способствует фокусированию лучей в линзе объектива микроскопа, что помогает сделать контуры исследуемого объекта (микроорганизма) более четкими (правая сторона рисунка).

 

Рис. 4. Принцип иммерсионной микроскопии (объяснение в тексте).

С. Методы окрашивания бактерий

Простые и сложные методы окрашивания.

   При простом методе окрашивания фиксированный мазок окрашивают каким-либо одним красителем, например фуксином (1-2 мин) или метиленовым синим (3-5 мин), промывают водой, высушивают и микроскопируют. Сложные методы включают последовательное нанесение на препарат красителей, различающихся по химическому составу и цвету. Это позволяет выявить определенные структуры клеток и дифференцировать одни виды микроорганизмов от других (окраска по методу Грама, Циля-Нельсена, Ожешко и др.). 

Окраска по Граму.

Среди методов окраски микроорганизмов наибольшее значение имеет метод Грама, по отношению к которому все бактерии можно разделить на три группы (таб. 2.): грамположительные, грамотрицательные и кислотоустойчивые бактерии (плохо воспринимают окраску по Граму). Грамположительные бактерии окрашиваются в темно-фиолетовый цвет, грамотрицательные - в красный. Отношение к окраске по Граму является важным диагностическим признаком при определении бактерий и всегда упоминается при их характеристике. Различие в реакции на окраску по методу Грама объясняется особенностями структуры клеточной стенки грамположительных и грамотрицательных бактерий, которые по-разному удерживают комплекс генцианового фиолетового с йодом. Генциановый фиолетовый (основной краситель) и йод входят в клеточную стенку и прочно связываются с ней. Клеточная стенка грамположительных бактерий имеет толстый, многослойный пептидогликан, кроме того, проницаемость клеточной стенки грамположительных микроорганизмов меньше, чем у грамотрицательных. Таким образом, у грамположительных микроорганизмов

Таблица 2. Сравнительная характеристика клеточной стенки грамположи

               тельных, грамотрицательных и кислотоустойчивых бактерий.

Характеристика	Грамположительные бактерии (Гр+)	Грамотрицательные бактерии (Гр-)	Кислотоустойчивые бактерии
Пептидогликан	Многослойный	Один слой	Относительно небольшое          количество
Тейхоевые кислоты	+	_	_
Наружная мембрана	_	+	_
Липополисахарид (эндотоксин)	_	+	_
Липиды	Небольшое             количество	Липополисахариды	Миколовые кислоты и гликолипиды
Пили	_	+	_

 

создаются оптимальные условия для прочной фиксации красителя и резистентности к обесцвечиванию спиртом. Грамотрицательные бактерии имеют тонкий пептидогликановый слой, который теряет генциановый фиолетовый после обработки спиртом, становясь бесцветным. Дополнительное окрашивание карболовым фуксином (вторая окраска) делает грамотрицательные бактерии, красными или розовыми (рис. 5).

  Бактерии, не имеющие пептидогликана (например, микоплазмы) или имеющие восковой внешний слой (например, микобактерии) не окрашивают по методу Грама.

 

 

Рис. 5. Принцип окраски по методу Грама.