Двойное оплодотворение у цветковых растений: Оплодотворение - это процесс слияния мужской и женской половых клеток с образованием зиготы...
Адаптации растений и животных к жизни в горах: Большое значение для жизни организмов в горах имеют степень расчленения, крутизна и экспозиционные различия склонов...
Топ:
Установка замедленного коксования: Чем выше температура и ниже давление, тем место разрыва углеродной цепи всё больше смещается к её концу и значительно возрастает...
Отражение на счетах бухгалтерского учета процесса приобретения: Процесс заготовления представляет систему экономических событий, включающих приобретение организацией у поставщиков сырья...
Эволюция кровеносной системы позвоночных животных: Биологическая эволюция – необратимый процесс исторического развития живой природы...
Интересное:
Инженерная защита территорий, зданий и сооружений от опасных геологических процессов: Изучение оползневых явлений, оценка устойчивости склонов и проектирование противооползневых сооружений — актуальнейшие задачи, стоящие перед отечественными...
Средства для ингаляционного наркоза: Наркоз наступает в результате вдыхания (ингаляции) средств, которое осуществляют или с помощью маски...
Берегоукрепление оползневых склонов: На прибрежных склонах основной причиной развития оползневых процессов является подмыв водами рек естественных склонов...
Дисциплины:
2017-06-25 | 400 |
5.00
из
|
Заказать работу |
|
|
Вторым важным этапом аналитической тонкослойной хроматографии является количественное определение разделенных компонентов пробы. В целом способы количественного анализа можно разделить на две группы. Первая группа включает способы, предполагающие предварительное извлечение с пластины адсорбента с зоной компонента и последующее определение его количества различными физико-химическими методами. Вторая группа позволяет определить количества вещества непосредственно на пластине путем:
· графического измерения (или визуальной оценки) размера пятна
(площади или длины зоны);
· с помощью инструментальных методов — сканирование пластины детектирующей системой.
Среди последней группы методов можно выделить:
· оптические (отражение, пропускание, отражение-пропускание,
флуориметрия, гашение флуоресценции);
· ядерно-физические (авторадиография, сцинтилляция — в этом случае проводят денситометрию не самой пластины, а контактных отпечатков с нее на фото- или рентгеновскую пленку);
· электрохимические (полярография, кондуктометрия);
· применение детекторов для газовой хроматографии и др.
Рассмотрим некоторые из приведенных методов более подробно.
К первой группе относятся методы экстракции пятен. Пластинку с пятном вещества помещают под УФ-лампу (длина волны излучения — 254 нм), и пятно обводят по периметру мягким карандашом. Сорбент в пределах отмеченной области извлекают шпателем и при помощи воронки переносят в центрифужную пробирку. Добавляют точный объем растворителя, тщательно перемешивают и центрифугируют. Надосадочную жидкость переносят пипеткой в кювету и проводят фотометрические измерения.
|
Более точные результаты получаются путем прямого элюирования с пластинки. В этом случае биопробу наносят в виде сплошной линии, затем пластинку проявляют; а хроматограмму помещают под УФ-лампу (длина волны излучения 254 или 360 нм). Зоны обводят мягким карандашом. Участок пластинки, несколько больший, чем зона выделенного вещества, вырезают и элюируют в специальном растворителе (элюент стекает сверху вниз непосредственно по слою сорбента). Полученный элюат можно анализировать подходящим методом (фотометрия, микротитрование, полярография и т. п.). При таком варианте нанесения биопробы удается провести разделение в пределах нескольких миллиграммов, а этого количества достаточно для применения спектрофотометрического анализа.
Ко второй группе относятся графические методы, основанные на измерении размеров и других параметров пятна, характеризующих форму (геометрию) хроматографических зон, непосредственно на пластинке.
Метод сравнения (качественный). Готовят серию стандартных растворов различной концентрации (например, 1, 2, 4, 8 мг/мл), которые наносят с определенными интервалами на пластинку (по 2 мкл). В промежутки между ними наносят биопробу, разведенную до определенной концентрации. После проявления хроматограммы сравнивают интенсивность окраски и размеры пятен и на этом основании оценивают концентрацию анализируемого вещества.
Метод определения размеров пятен (эмпирический). Для одинаковых размеров стартовых пятен в пределах определенных величин существует линейная зависимость:
S = nlgq + р, где S — площадь пятна; q — масса вещества; n, р — константы, определяемые из калибровочных графиков (формула справедлива только при небольшой разнице в количестве вещества в исследуемых зонах).
Однако из-за несовершенного детектирования границ пятна эта зависимость не всегда выполняется. Поэтому количественная оценка может быть проведена только прямым сравнением с серией эталонных растворов, которые наносят на одну пластину с исследуемыми пробами. Строят графическую зависимость в координатах {S, lgq} по эталонным образцам, определяют площадь пятна анализируемой пробы и по калибровочному графику находят количество вещества в пятне. Определение площади пятна проводят следующим образом: после проявления на пластинку помещают лист прозрачной миллиметровой бумаги и определяют площадь пятна в квадратных миллиметрах. Погрешность метода составляет 4—10 %. Она может быть уменьшена путем усреднения результатов многократных замеров и при использовании технических средств анализа изображений.
|
Часто используют также метод внутреннего стандарта, при котором готовят три раствора:
· с неизвестной концентрацией определяемого компонента (раствор 1);
· разбавленный в одиннадцать раз раствор 1 (раствор 2);
· раствор 2 с добавлением определенного количества эталона (раствор 3).
Затем эти растворы в равных объемах наносят на пластинку и после проведения тонкослойной хроматографии определяют по формуле количество неизвестного компонента.
Сканирующие методы. Для количественной оценки результатов используют денситометр, по возможности, в блоке с ЭВМ. Обычно пластинку сканируют в продольном направлении (рис.5) узким пучком излучения, вытянутым параллельно стартовой линии, геометрические размеры которой определяются размерами диафрагмы. Длина волны источника излучения должна соответствовать области поглощения анализируемых веществ. По длине пучок излучения должен быть сопоставим с размерами сканируемых пятен. Результаты сканирования более стабильны, если длина щели меньше диаметра пятна.
Рис.5. Сканирование пластинок тонкослойной хроматографии: а — вид пластинки сверху; б — хроматограмма, полученная на выходе денситометра.
|
|
Своеобразие русской архитектуры: Основной материал – дерево – быстрота постройки, но недолговечность и необходимость деления...
Историки об Елизавете Петровне: Елизавета попала между двумя встречными культурными течениями, воспитывалась среди новых европейских веяний и преданий...
Биохимия спиртового брожения: Основу технологии получения пива составляет спиртовое брожение, - при котором сахар превращается...
Механическое удерживание земляных масс: Механическое удерживание земляных масс на склоне обеспечивают контрфорсными сооружениями различных конструкций...
© cyberpedia.su 2017-2024 - Не является автором материалов. Исключительное право сохранено за автором текста.
Если вы не хотите, чтобы данный материал был у нас на сайте, перейдите по ссылке: Нарушение авторских прав. Мы поможем в написании вашей работы!